Как нос помнит, что это нос? Или глаз помнит, что это глаз?

Теперь команда исследователей из трех лабораторий Мичиганского университета смогла отследить, как белок связывается со своим хроматиновым субстратом в живой клетке, установив сотрудничество, которое сочетает в себе ультрасовременную визуализацию с ультравысоким разрешением, синтетический белковый дизайн и компьютерное моделирование. Их результаты опубликованы в журнале Science Advances.

"Биологический вопрос, который мы задаем, заключается в следующем: "Как клетки на самом деле помнят прошлый опыт? И как этот опыт также приводит к тому, что клетки устанавливают различные идентичности, как это происходит в случае человеческого тела, где у вас есть линии клеток, которые формируют нейроны, или клетки крови, или клетки мозга, и все они фактически сохраняют свою идентичность на протяжении многих поколений ", - сказал ведущий автор Каушик Рагунатан, доктор философии.Д., доцент кафедры биологической химии в Медицинской школе U-M.

"Пример, о котором мне нравится думать, заключается в том, что если вы отрубите себе нос, у вас не вырастет рука, хотя геном в вашем носу и геном в вашей руке совершенно одинаковы".

Клетки контролируют, как и какие гены экспрессируются, с помощью копии последовательности ДНК, содержащейся в каждой клетке, несмотря на то, что эта последовательность одинакова во всех клетках организма. Один из способов контролировать экспрессию - изменять плотность упаковки ДНК в ядре с помощью белков, называемых "гистонами". Гистоны можно модифицировать путем добавления небольших химических меток, которые регулируют, насколько плотно ДНК намотана вокруг них и, следовательно, могут ли гены экспрессироваться.

По словам Рагунатана, белки, которые обладают способностью считывать, записывать и стирать эти гистоновые метки, исследуют ДНК в ядре клетки очень быстро — порядка миллисекунд. В конечном счете, вся эта эпигенетическая информация должна передаваться по наследству из поколения в поколение, но распознавание этих меток - сложный процесс, который включает связывание хроматина и встречу белков и взаимодействие друг с другом среди хаоса всех других возможных конкурирующих взаимодействий внутри клетки.

Способность понимать каждый этап процесса и, следовательно, возможность контролировать то, как наследуется эпигенетическая информация, заинтриговала соавтора Джули Битин, доктора философии, профессора химии и биофизики.

Biteen использует одномолекулярную флуоресцентную визуализацию для отслеживания отдельных белков внутри клеток. Ее лаборатория может видеть, где эти белки находятся относительно хроматина, а опыт Рагунатан заключается в молекулярных механизмах, лежащих в основе взаимодействия модификаций гистонов и гистоносвязывающих белков. Эти два мира должны были объединиться, чтобы можно было проверить биохимию того, что происходит в пробирке вне клеток, чтобы выяснить, что происходит внутри них.

"Время этого процесса критически важно для обеспечения того, чтобы нужные гены были отключены в нужном месте и в нужное время", - сказал Битин. "Что меня зацепило в этом проекте, так это то, что in vitro — в пробирке — вы можете очистить два белка, посмотреть, как они связываются, и посмотреть, насколько хорошо это связывание или каково сродство друг к другу. Это говорит вам о том, что может произойти в клетках, но не о том, что происходит в клетках ".

Битин и Рагунатан работали с Питером Фреддолино, доктором философии, адъюнкт-профессором биологической химии, вычислительной медицины и биоинформатики в Медицинской школе U-M., чтобы объединить компьютерное моделирование со своими экспериментальными результатами.

"Это действительно то, где наше сотрудничество становится действительно мощным", - сказал Битин. "С одной стороны, видеть молекулы очень полезно, и знание того, как быстро движутся молекулы, очень помогает с точки зрения понимания того, что возможно внутри клетки, но здесь мы могли бы сделать шаг вперед, нарушив систему даже неестественными способами, чтобы понять, что представляют собой эти различные движения молекул в клеткена самом деле означает."

Хотя эпигенетические метки чрезвычайно важны для поддержания различных тканей в сложных организмах, таких как люди, они также играют важную роль в регулировании генов одноклеточных организмов, таких как дрожжи. Команда сосредоточилась на типе белка HP1 в дрожжевых клетках, который называется Swi6. Это семейство белков связывается с определенным типом модификаций гистонов в клетке, чтобы заставить ген замолчать. Интегрируя флуоресцентные метки с Swi6, лаборатория Bitee наблюдала, как Swi6 перемещается внутри ядра клетки.

По словам Битина, в то время как Swi6 ищет правильный сайт связывания в ДНК, он движется быстро. Когда она находит свою цель, она значительно замедляется. Движение белка внутри клетки сродни передаче в автомобиле, и вещи могут двигаться с разной скоростью в зависимости от того, с кем взаимодействуют белки.

"По этим спагетти-трекам, которые мы получаем внутри клетки, мы затем выясняем, сколько времени они тратят на поиск и сколько времени они тратят на привязку", - сказал Битин. "Количество времени, которое они проводят без движения, говорит нам о том, насколько сильно они взаимодействуют и их биохимических свойствах".

В то время как лаборатория Битин может измерять движения в клетке в масштабе десятков миллисекунд, большая часть биохимических процессов, происходящих в клетке, происходит еще быстрее, сказала она. Фреддолино взял эту экспериментальную информацию и разработал модели для оценки способности белков Swi6 переключаться между состояниями связывания, которые были определены в экспериментах.

Моделирование Фреддолино учитывало экспериментальные измерения и возможные биохимические свойства, в том числе то, как молекулы Swi6 взаимодействуют в клетке. По его словам, эти взаимодействия включают молекулы, которые свободно плавают в растворе клетки, молекулы, которые связаны с ДНК, и молекулы, которые "держатся за руки" друг с другом.

"Моя лаборатория хотела разработать более детализированную модель, которая оценивала бы наиболее вероятный набор молекулярных состояний белков и их способность переключаться между этими состояниями, что затем привело бы к появлению данных визуализации, созданных лабораторией Битина", - сказал Фреддолино.

"Наличие этой численной модели позволяет нам проводить вычислительные эксперименты, чтобы выяснить, что произойдет, если связывание белка происходит в два раза быстрее, чем мы думаем. Что, если это в 10 раз быстрее, чем мы думаем? Или в 10 раз медленнее? Может ли это по-прежнему приводить к появлению данных? К счастью, в этом случае мы смогли показать, что соответствующие процессы действительно фиксируются с помощью флуоресцентной микроскопии ".

После определения связывающих свойств природного Swi6 исследователи проверили свои результаты, переделав Swi6 из его компонентов, чтобы посмотреть, смогут ли они воспроизвести некоторые из его биохимических свойств, сказал Рагунатан. Это позволило исследователям определить, что визуализация и моделирование, проведенные в первой части статьи, отражают то, как белок связывался в своей естественной среде.

"Можем ли мы сделать то, что делала природа в течение миллионов лет, и создать белок, который во многих отношениях обладает свойствами, подобными свойствам Swi6 в клетках?" Сказал Рагунатан. "Биохимия In vivo, которую мы решили назвать так, никогда не считалась возможной внутри живых клеток, но мы показали, что это вполне возможно, используя визуализацию в качестве метода. Мы используем этот проект в качестве основы, чтобы понять, как эти эпигенетические состояния могут устанавливаться и поддерживаться из поколения в поколение".